?顯微鏡觀察

微生物—顧名思義，就是十分微小的生命體。以人類肉眼是很難看見微生物的外觀，更何況是研究其外部型態以及內部構造。因此在微生物學中，使用顯微鏡的觀察十分重要。除了觀看微生物的外觀之外，許多的測試以及化學作用的呈色結果，都需要依靠顯微鏡的觀察。

?公制單位與顯微鏡的使用

?學習目標：于本次實驗結束后你應該知道

1. 各公制單位之名稱、代表數值及各單位間的轉換
2. 復式光學顯微鏡各部位的名稱及功能
3. 解剖顯微鏡各部位的名稱及功能
4. 比較復式光學顯微鏡及電子顯微鏡之間的差異
5. 字母“?e?”經過復式光學顯微鏡轉換后之影像
6. 如何計算視野直徑及各鏡頭下之放大倍率
7. 如何計算鏡頭下各細胞及標本之實際大小
8. 依序寫出使用復式光學顯微鏡觀察之步驟
9. 光學顯微鏡鏡頭的保養方法
10. 油鏡的使用方法及使用之后如何去除鏡頭及玻片上的油

?概述

1. 公制單位 -----采十進位法

各公制單位的名稱及代表意義如下表所示：
Table 2-1. Metric Unit Values ??& Conversion（長度單位）

Table 2-2. Metric Unit Values ??& Conversion（重量單位）

Table 2-3. Metric Unit Values ??& Conversion（體積單位）

同學必須熟練各單位之間的轉換，例如：

3.5 cm = 3.5?×?10?-2?m = 3.5?×?10?-2?×?10?6?mm = 3.5?×?10?4?mm

轉換單位之目的在于避免使用極大或極小之數字。

?2.?顯微鏡?( MICROSCOPE )

????人的肉眼由于先天的限制，在25 cm的明視距離下，只能分辨相距0.2 mm以上的兩點（即解析力( resolving power )為0.2 mm），對于更微小的物體，就必須借助于顯微鏡。無論是何種顯微鏡，其主要功能都在于將影像放大?( magnification )，并增加影像的明暗對比( contrast )。

????顯微鏡種類繁多，依其呈像原理大致可以分為光學顯微鏡和電子顯微鏡兩大類。兩者差異如下表所示：

Table 2-4. A Comparison of Light and Electron Microscopes

增加光學顯微鏡影像的明暗對比的方法很多，例如利用染色法處理樣本，或在顯微鏡上附加特殊裝置（例如位相差顯微鏡、暗視野顯微鏡、干涉顯微鏡、偏光顯微鏡、X光顯微鏡、螢光顯微鏡、紫外光顯微鏡等）。

本學年同學將使用到的顯微鏡有雙目鏡復式光學顯微鏡及雙目鏡解剖顯微鏡兩種，以下將分別介紹其各部位的名稱及功能。

?(1) 雙目鏡復式光學顯微鏡

1. 接目鏡：放大倍率為10×，可因應各人的雙眼距離來調整，內安裝有目鏡測微尺，有些另裝有指針，裝有目鏡測微尺的接目鏡上有調節輪，可因應各人焦距來調整。
2. 鏡筒：介于接目鏡與接物鏡之間。
3. 旋轉盤：接于鏡筒下方，通常有四個接孔，可接不同倍數的接物鏡，本身可以旋轉借以更換不同倍數的接物鏡。
4. 接物鏡：有scanning power objective ( 3.2?×?)、low power objective ( 10?×?)、high power objective ( 40?×?)、oil immersion objective ( 100?×?)四種。
5. 載物臺：為放置標本玻片的平臺，中央有一圓孔，可供光線通過。我們所使用的載物臺為機械式載物臺，上面有玻片夾及調節鈕( mechanical stage control knobs )，可固定玻片及調整玻片位置。
6. 集光器( Condenser )：位于載物臺下方中央，由許多透鏡組合而成，用以集合光線，使之投射于標本上。
7. 光圈(虹膜) ( Iris diaphragm )：連接于集光器下方，上有一支調整柄?( aperture diaphragm control )，可用以調整光圈孔徑大小，以調整投射于標本上之光線強弱。
8. 照明器( Illuminator )：位于鏡座上，內設光源為鎢絲燈，直接提供觀察所需之光源。
9. 鏡臂( Arm )：連接鏡筒及鏡座，并供握取顯微鏡。
10. 調節輪( Adjustment knob )：位于鏡柱兩側，可調整載物臺的升降，以供對焦。依順時鐘方向（遠離自己身體方向）旋轉，則載物臺上升，反之則下降（＊注意：此方向有時依機型廠牌不同而異，也有調節輪是調節鏡筒之升降者，首次使用時可先緩慢旋轉試試看即可確定）。
11. 鏡座( Base )：顯微鏡之最底部。其右側有光源調整鈕，可調整照明器內光源亮度；后方接有電源線，有時尚有光源開關。

?(2) 雙目鏡解剖顯微鏡(Binocular dissecting microscope) (Stereomicroscope)

1. 接目鏡( Eyepiece )：放大倍率為?8?×?( M1A機型)或10?×?( M3機型)，有些的接目鏡上有調節輪( M3機型)，可因應各人焦距來調整。
2. 鏡筒( Body tube )：介于接目鏡與接物鏡之間。
3. 接物鏡( Objective )：M1A機型只有1?×一種；M3機型則有6.4?×、10?×、40?×三種，鏡筒兩側有切換鈕，可切換三種不同倍數的物鏡。
4. 調節輪( focusing knob )：位于鏡柱兩側，可調整接物鏡的升降，以供對焦。依順時鐘方向（遠離自己身體方向）旋轉，則接物鏡上升，反之則下降。
5. 鏡柱( Pillar )：連接鏡筒及鏡座，并供握取顯微鏡。
6. 照明器( Illuminator )：位于鏡座上，內設光源為鎢絲燈，直接提供觀察所需之光源（※注意：由于此光源為熱光源，使用時會發熱，應避免直接接觸照明器，以免燙傷），開關在電源線上。
7. 鏡座( Base )：顯微鏡之最底部。其上有載物臺，為一圓盤，有黑白兩色，可依需要自行變換。

?3. 復式光學顯微鏡的使用方法

(1)?顯微鏡的取用

• A.一手握鏡臂，一手托住鏡座，將顯微鏡輕輕放置在桌上，距桌緣約一個姆指距離之處。
• B.調整坐椅至適當高度，使自己可以輕松地使用顯微鏡。
• C.取95%酒精及拭鏡紙，將所有鏡頭擦拭干凈（※注意：僅能以單一直線方向擦拭）。
• D.將玻片標本平穩地放在載物臺上，以玻片夾夾好（※注意：請確認是否夾好，以免玻片跳起，造成同學受傷或損及顯微鏡鏡頭）。

(2)?低倍鏡的使用

• A.先將載物臺降至最低點，轉動旋轉盤( Revolving nosepiece )，使低倍鏡位于鏡筒正下方。
• B.打開光源，調整光源調整鈕及光圈( Iris diaphragm )，使視野中之亮度適當。
• C.將所要觀察的玻片放在載物臺上，以玻片夾夾好，并轉動調節鈕?( mechanical stage control knobs )以調整玻片位置。轉動調節輪?( Adjustment knob )，至低倍鏡與載物臺相距約0.1 cm（或載物臺無法再上升）為止。
• D.由接目鏡觀察，同時以靠向自己的方向緩緩轉動調節輪( Adjustment knob )，使載物臺下降，直到影像清晰為止。若視野太亮或太暗，皆可調整光源調整鈕及光圈( Iris diaphragm )，使視野中之亮度適當。

(3)?高倍鏡的使用

• A.先使用低倍鏡找到欲觀察的目標，將該部位調整至視野中央。
• B.重覆“?低倍鏡的使用?”方法之A.~D.。

(4)?油鏡的使用

• A.先使用高倍鏡找到欲觀察的目標，將該部位調整至視野中央。
• B.將高倍鏡轉開，加一小滴油鏡專用油( immersion oil )于所見物像范圍的玻片上（即光線照亮的區域），換用100倍接物鏡（即oil immersion objective），小心將油鏡浸于油中，重新調整光圈，并緩慢轉動調節輪( Adjustment knob )，直到影像清晰為止。

(5)?注意事項

1. 嚴忌單手提取顯微鏡。
2. 若須移動顯微鏡，務必將顯微鏡提起再放至適當位置，嚴忌推動顯微鏡（推動時造成的震動可能會導致顯微鏡內部零件的松動，切記!!），使用顯微鏡請務必小心輕放。
3. 使用顯微鏡時坐椅的高度應適當，觀察時更應習慣兩眼同時觀察，且光圈及光源亮度皆應適當，否則長時間觀察時極易感覺疲勞。
4. 轉動旋轉盤時務必將載物臺降至最低點，以免因操作不當而刮傷接目鏡之鏡頭。
5. 標本染色或其他任何操作皆應將玻片取下，操作完成后再放回載物臺觀察，切勿在載物臺上操作，以免染劑或其他液體流入顯微鏡內部或傷及鏡頭。
6. 觀察完一種材料，欲更換另一種材料時，務必將載物臺下降至最低點，換好玻片后再依標準程序重新對焦，切勿直接抽換標本，以免刮傷鏡頭或玻片標本。
7. 顯微鏡使用前后皆應以拭鏡紙( Lens paper )及95% Alcohol清潔所有鏡頭，擦拭時 ??應沿單一直線方向輕拭，不可旋轉磨擦。
8. 擦拭顯微鏡鏡頭時只能用拭鏡紙( Lens paper )，切勿用其他紙張或手指接觸鏡頭。
9. 用畢顯微鏡應將載物臺下降至最低點，并將低倍鏡對準載物臺中央圓孔處，將電源線卷好，蓋上防塵罩，并收入存放柜中。
10. 若長期不使用，應以Xylene ( Xylol )清潔所有鏡頭。

?4. 放大倍數 &顯微測量法

顯微鏡之放大倍數之近似值，趨近于接目鏡與接物鏡放大倍率之乘積，但由于制作時的差異，每一個鏡頭皆有些許不同的誤差。欲得知所觀察物體的實際大小，首先在目鏡的兩鏡頭之間加裝一個目鏡測微尺?( Ocular micrometer )（如圖2-1a所示）。在載物臺上置一載物臺測微尺?( Stage micrometer )（如圖2-1b所示），該測微尺為載玻片上刻有一段劃分1 mm為100小格的直線，即載物臺測微尺上每小格的長度為0.01 mm (10m m )。使用方法為：移動載物臺測微尺，使兩測微尺之一端刻度重疊成一直線，再檢視另一端刻度重疊處，分別計算此一區間內，兩測微尺上之格數，則目鏡測微尺上每一格長度之計算如下：

圖2-1（a）兩種不同的目鏡測微尺（Ocular micrometer）

（b）載物臺測微尺（Stage micrometer）

?5. 解剖顯微鏡的使用方法

解剖顯微鏡又稱立體顯微鏡?( stereomicroscope )，其使用及維護方法與復式光學顯微鏡類似。